Ein pentamerer TRPV3-Kanal mit einer erweiterten Pore

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TRP-Kanäle (Transient Receptor Potential) sind eine große eukaryotische Ionenkanal-Superfamilie, die verschiedene physiologische Funktionen steuert und daher attraktive Angriffspunkte für Arzneimittel sind1,2,3,4,5. Mehr als 210 Strukturen von mehr als 20 verschiedenen TRP-Kanälen wurden bestimmt, und alle sind Tetramere4. Trotz dieser Fülle an Strukturen sind viele Aspekte von TRPV-Kanälen noch immer kaum verstanden, einschließlich des Porenerweiterungsphänomens, bei dem eine längere Aktivierung zu einer erhöhten Leitfähigkeit, Permeabilität für große Ionen und einem Verlust der Gleichrichtung führt6,7. Hier verwendeten wir Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM), um membraneingebettetes TRPV3 auf Einzelmolekülebene zu analysieren und entdeckten einen pentameren Zustand. Die dynamische HS-AFM-Bildgebung zeigte die Vergänglichkeit und Reversibilität des Pentamers im dynamischen Gleichgewicht mit dem kanonischen Tetramer durch membrandiffusiven Protomeraustausch. Die Pentamerpopulation nahm durch Zugabe von Diphenylboronsäureanhydrid (DPBA) zu, einem Agonisten, der nachweislich die Porenerweiterung von TRPV3 induziert. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse haben wir eine Proteinproduktions- und Datenanalyse-Pipeline entworfen, die zu einer kryogenen Elektronenmikroskopie-Struktur des TRPV3-Pentamers führte, die im Vergleich zum Tetramer eine vergrößerte Pore zeigte. Die langsame Kinetik beim Ein- und Austritt in den pentameren Zustand, die verstärkte Pentamerbildung bei DPBA-Zugabe und die vergrößerte Pore deuten darauf hin, dass das Pentamer das strukturelle Korrelat der Porenerweiterung darstellt. Wir zeigen daher den membrandiffusiven Protomeraustausch als zusätzlichen Mechanismus für Strukturänderungen und Konformationsvariabilität. Insgesamt liefern wir strukturelle Beweise für eine nicht-kanonische pentamere TRP-Kanal-Anordnung und legen damit den Grundstein für neue Richtungen in der TRP-Kanalforschung.

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Alle Daten und Materialien, um die Schlussfolgerungen in diesem Papier zu ziehen, werden im Haupttext, in den Abbildungen sowie in den erweiterten Datenabbildungen und ergänzenden Videos dargestellt. Die Kryo-EM-Karten des TRPV3-Tetramers und -Pentamers wurden in der Electron Microscopy Data Bank mit den Zugangscodes EMD-40181 bzw. EMD-40183 hinterlegt, und ihre Strukturmodelle wurden im PDB mit den Zugangscodes 8GKA und 8GKG hinterlegt. bzw. (Erweiterte Datentabelle 1). Weitere Daten können auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor eingeholt werden.

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Wir danken A. Accardi und J. Dittman für wichtige Diskussionen. Negativ gefärbte EM-Daten wurden in den Elektronenmikroskopie- und Histologiediensten des Weill Cornell Medicine Microscopy & Image Analysis Core unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops gesammelt, das mit Mitteln eines National Institutes of Health (NIH) Shared Instrumentation Grant (Nr. S10RR027699) erworben wurde Gemeinsame Ressourcen. Kryo-EM-Daten wurden am Simons Electron Microscopy Center am New York Structural Biology Center mit Unterstützung der Simons Foundation (Fördernummer SF349247) gesammelt. Die Arbeit im Scheuring-Labor wird teilweise durch Zuschüsse des NIH, National Center for Complementary and Integrative Health (NCCIH), Zuschuss-Nr. DP1AT010874 (an SS) und National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Grant-Nr. R01NS110790 (zu SS). Die Arbeit im Yuan-Labor wird teilweise durch das Stipendium Nr. unterstützt. NIH NINDS R01NS099341 (bis PY). Die Arbeit im Nimigean-Labor wird teilweise durch das Stipendium Nr. unterstützt. NIH NIMGS R01 GM088352 (an CMN) und Grant-Nr. NIH NIMGS F32 GM145091 (an EDK). SL ist Preisträgerin des Women's Postdoctoral Career Development Award des Weizmann Institute of Science.

Abteilung für Anästhesiologie, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim, Crina M. Nimigean und Simon Scheuring

Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, Graduate School of Medical Sciences, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

John Michael Betancourt

Abteilung für Zellbiologie und Physiologie, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Jingying Zhang & Peng Yuan

Zentrum für die Untersuchung von Membranerregbarkeitskrankheiten, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO, USA

Jingying Zhang & Peng Yuan

Abteilung für Pharmakologische Wissenschaften, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Jingying Zhang & Peng Yuan

Programm für Biochemie und Strukturbiologie, Zell- und Entwicklungsbiologie und Molekularbiologie, Graduate School of Medical Sciences, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Yining Jiang

Programm für Strukturbiologie, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA

Navid Paknejad

Graduiertenprogramm für Physiologie, Biophysik und Systembiologie, Weill Cornell Medical College, New York, NY, USA

Navid Paknejad

Abteilung für Physiologie und Biophysik, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Crina M. Nimigean & Simon Scheuring

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SL und SS haben die Studie entworfen. JZ und PY exprimierten und gereinigtes Protein aus P. pastoris-Zellen. SL, JMB und EDK exprimierten und gereinigtes Protein aus HEK-GnTI−-Zellen. SL und JMB rekonstituiertes Protein. SL führte eine EM-Bildgebung mit negativer Färbung durch. SL, EDK und CMN führten elektrophysiologische Messungen durch und analysierten sie. SL und JMB führten eine HS-AFM-Bildgebung durch. SL und YJ führten eine HS-AFM-Datenanalyse durch. SL und JMB führten nanoDSF-Experimente und -Analysen durch. SL und JMB führten die Kryo-EM-Probenvorbereitung und Datenerfassung durch. SL, EDK und NP analysierten Einzelpartikel-Kryo-EM-Daten. SL und SS führten eine Kanalstrukturanalyse durch. YJ führte eine Oligomersimulation durch und analysierte sie. SL und SS haben den Aufsatz geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet. SS überwachte das Projekt.

Korrespondenz mit Simon Scheuring.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Ute Hellmich, Thomas Voets und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Repräsentative Strukturen (von >210 Strukturen) der 23 bisher gelösten TRP-Kanäle. Alle Strukturen sind Tetramere, wobei die vier Untereinheiten in Weizen, Grün, Lila und Gelb gefärbt sind. Jede Struktur wird in Oberflächendarstellung dargestellt, dargestellt aus der intrazellulären (oben) und seitlichen (unten) Ansicht. Das Fragezeichen im crTRP1-Panel bedeutet, dass die Unterfamilie, zu der crTRP1 gehört, noch unbekannt ist.

(a) und (b) Repräsentative Einzelkanalaufzeichnungen von TRPV3 in Abwesenheit (a) und Anwesenheit (b) von 100 μM DPBA bei –50 und 50 mV. (c) Sinus-Kanal-Strom-Spannungs-Kurven (IV) von TRPV3, erhalten von –100 bis 100 mV, in Abwesenheit und Anwesenheit von 100 μM DPBA. (d) Einzelkanal-Offenheitswahrscheinlichkeiten, ermittelt aus Aufzeichnungen, die bei –50 mV in Abwesenheit und Anwesenheit von 100 μM DPBA erhalten wurden. Offene Wahrscheinlichkeitswerte (0,27 ± 0,01 bzw. 0,78 ± 0,05) wurden als Mittelwerte +/− Standardabweichung aus n ≥ 3 unabhängigen Experimenten (Kreise) abgeleitet. Die statistische Signifikanz wurde mit dem einseitigen Welch-T-Test bewertet und ergab einen signifikanten (p-Wert = 0,0007) Anstieg der Wahrscheinlichkeit eines offenen Kanals nach der Zugabe von DPBA. Alle Aufzeichnungen wurden auf TRPV3-Kanälen aus einer Reinigung nach dem gleichen Proteinexpressions- und Reinigungsprotokoll wie für die Kryo-EM-Analyse durchgeführt und nach dem gleichen Protokoll wie für die HS-AFM-Analyse rekonstituiert, allerdings bei einem höheren Lipid-zu-Protein-Verhältnis (LPR). (zwischen 5 und 20 für elektrophysiologische Aufzeichnungen vs. LPR zwischen 0,5 und 2,5 für HS-AFM-Experimente). *** p-Wert < 0,005.

(a) bis (f) Tetramer-zu-Pentamer-Übergänge. (g) bis (k) Pentamer-Tetramer-Übergänge. (l) Tetramer-Pentamer-Tetramer-Übergang. (m) Pentamer-Tetramer-Pentamer-Tetramer-Pentamer-Tetramer-Übergang. Weiße Pfeilspitzen zeigen die gelegentlich beobachteten Monomere an, die Tetramere „angreifen“ und in diese einfügen, um Pentamere zu ergeben, sowie die beobachteten Monomere, die von Pentameren dissoziieren und Tetramere ergeben.

(a) TRPV3-Tetramere und -Pentamere koexistieren neben TRPV3 ≤ 3 Protomerfragmenten. Graue Pfeilspitzen zeigen Monomer- (1), Dimer- (2) und Trimer- (3) Fragmente an. (b) und (c) TRPV3-Tetramer-Aufspaltung in Trimer und Dimer. (d) TRPV3-Fragmente bilden ein stabiles Tetramer, das dann auseinanderbricht.

Flussdiagramm für die Kryo-EM-Datenverarbeitung, Partikelauswahl, Klassifizierung und Rekonstruktion, das eine Kartenrekonstruktion des Tetramers mit einer Auflösung von 2,55 Å und für das Pentamer mit einer Auflösung von 4,38 Å ermöglicht. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Verarbeitungsschritte in cryoSPARC Version 3.3.2 durchgeführt. Gestrichelte Linien zeigen die Eingaben an, die für die iterativen Zyklen der heterogenen Verfeinerung verwendet werden.

(a) und (b) Kryo-EM-rekonstruierte Karten des TRPV3-Tetramers (a) und des Pentamers (b), gefärbt entsprechend der lokalen Auflösung unter Verwendung einer Regenbogenfarbskala. (c) und (d) Repräsentative Kryo-EM-Dichten des Tetramers (Konturniveau bei 5,5 RMSD) (c) und des Pentamers (Konturniveau bei 4,16 RMSD) (d) bei einer Auflösung von 2,55 Å bzw. 4,38 Å (die TMDs). in der Pentamer-Karte haben eine Auflösung von ~5,0–5,5 Å, siehe Farbschema der lokalen Auflösung in (b)).

(a) und (b) TRPV3-Tetramer- (a) und -Pentamer-Strukturen (b), gefärbt nach Domänen: ARD in Lila, VSLD in Gelb, PD in Rosa, SF in Grün, TRP-Helix in Weizen, Kopplungsdomäne in Hellblau . (c) bis (e) Überlagerung einer Pentamer-Untereinheit (lila) auf der Tetramer-Untereinheit (grün), ausgerichtet in Bezug auf die PD, was auf eine Scharnierbewegung im Pentamer-Monomer um 18° hinweist, die sich in der Drehung des ARD manifestiert ( c), VSLD und TRP-Helix (d). Diese Gelenkbewegung ermöglicht die Erhaltung der Interaktionen zwischen S5 mit S1 und S4 sowie der SF-SF- und S6-S6-Interaktionen (e). Benachbarte Untereinheiten in Grau. Offene Buchgrafiken der Kontaktflächen zwischen den Untereinheiten des Tetramers (f, grün) und des Pentamers (g, lila). Kontaktflächen sind rosa (im Tetramer) und gelb (im Pentamer) gefärbt.

TRPV3-Tetramere können dissoziieren. Die Dissoziation wird durch die Aktivierung aufgrund der Destabilisierung der Interprotomer-Wechselwirkung, insbesondere der VSLD-PD-Domänenaustauschschnittstelle, durch Helix-interkalierende Moleküle (z. B. Capsaicin oder LPA in TRPV1, DPBA in TRPV3, Temperatur) begünstigt. Monomere können Tetramere „angreifen“ und in diese einfügen, um Pentamere mit einem geschätzten ~2,4-fach vergrößerten Porendurchmesser an der SF zu ergeben. Pentamere haben eine Lebensdauer von ca. 3 Minuten, sind aufgrund der fragileren VSLD-PD-Schnittstellen weniger stabil als Tetramere und stoßen Untereinheiten ab, um den tetrameren Zustand wiederherzustellen (Abbildung erstellt mit BioRender.com).

(a) Visualisierung simulierter Spuren. Jede Spalte stellt einen unabhängigen Raum dar, der entweder leer (0) oder von einem Molekül mit einem bestimmten oligomeren Zustand (1, 2, 3, 4 oder 5) besetzt sein kann. Gesamtraum: 5250. Gesamtzeitschritt: 2000. Ersteinrichtung (Zeitschritt = 1): 5000 von 5250 Räumen hatten einen Wert von 4 (Tetramere) und 250 von den 5250 Räumen hatten einen Wert von 0 (leer). (b) und (c) Nahaufnahmen der simulierten Spuren in (a), wie durch die gestrichelten Kästchen angegeben. 1: Leer → Monomer → Dimer → Trimer → Tetramer → Pentamer-Übergang. 2: Übergänge zwischen Tetramer- und Pentamer-Zuständen (mit kurzen Pentamer-Verweilzeiten). 3: Ein langes Pentamer-Zustandsereignis. 4: Pentamer → Tetramer → Trimer → Dimer → Monomer → leerer Übergang. (d) Zeitliche Entwicklung der Oligomerzahlen. Oberes Feld: Tetramere. Mittleres Feld: Pentamere und niedere Oligomere (Trimer, Dimer und Monomer) aggregiert. Unteres Feld: Trimere, Dimere und Monomere. (e) Verweilzeiten im Oligomerzustand. Von links nach rechts: Niedere Oligomere (n = 34984), Tetramer (n = 278141) und Pentamer (n = 331579).

Diese Datei enthält ergänzende Abbildungen. 1–6, Tabellen 1–3 und Code.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,80 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution. Bildrate, 2 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,80 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,27 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,40 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate: 1,5 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,33 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,50 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,40 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate: 0,5 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,48 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate, 2 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,40 nm pro Pixel.

Hochauflösende HS-AFM-Videos tetramerer TRPV3-Kanäle. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,20 nm pro Pixel.

Hochauflösende HS-AFM-Videos eines tetrameren und pentameren TRPV3-Kanals. Bildrate: 0,3 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,12 nm pro Pixel.

Hochauflösende HS-AFM-Videos pentamerer TRPV3-Kanäle. Bildrate: 1,5 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,25 nm pro Pixel.

Hochauflösende HS-AFM-Videos eines tetrameren und pentameren TRPV3-Kanals. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,35 nm pro Pixel.

Hochauflösende HS-AFM-Videos eines tetrameren und pentameren TRPV3-Kanals. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,20 nm pro Pixel.

HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das einen Tetramer-Pentamer-Übergang zeigt. Das linke Feld zeigt einen Überblick über die TRPV3-Rekonstitution. Das obere rechte Feld zeigt den Tetramer-Pentamer-Übergang eines einzelnen Moleküls. Das untere rechte Feld zeigt den Durchschnitt (t, t + 2) des Einzelmolekül-Tetramer-Pentamer-Übergangs. Bildrate, 2 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,28 nm pro Pixel.

HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das zwei Pentamer-Tetramer-Übergänge zeigt. Das linke Feld zeigt einen Überblick über die TRPV3-Rekonstitution. Das obere rechte Feld zeigt Einzelmolekül-Pentamer-Tetramer-Übergänge. Das untere rechte Feld zeigt den Durchschnitt (t, t + 2) der Pentamer-Tetramer-Übergänge einzelner Moleküle. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,25 nm pro Pixel.

HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das einen Pentamer-Tetramer-Übergang zeigt. Das linke Feld zeigt einen Überblick über die TRPV3-Rekonstitution. Das obere rechte Feld zeigt den Einzelmolekül-Pentamer-Tetramer-Übergang. Das untere rechte Feld zeigt den Durchschnitt (t, t + 2) des Pentamer-Tetramer-Übergangs eines einzelnen Moleküls. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,35 nm pro Pixel.

HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution, das einen vollständigen Tetramer-Pentamer-Tetramer-Übergang zeigt. Das linke Feld zeigt einen Überblick über die TRPV3-Rekonstitution. Das obere rechte Feld zeigt den vollständigen Tetramer-Pentamer-Tetramer-Übergang eines einzelnen Moleküls. Das untere rechte Feld zeigt den Durchschnitt (t, t + 2) des vollständigen Tetramer-Pentamer-Tetramer-Übergangs eines einzelnen Moleküls. Bildrate: 1,5 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,33 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution in Gegenwart von 320 μM DPBA, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate, 1 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,40 nm pro Pixel.

Übersichts-HS-AFM-Video der TRPV3-Rekonstitution in Gegenwart von 320 μM DPBA, das mehrere Kanäle mit pentameren oligomeren Zuständen zeigt. Bildrate, 2 s pro Bild. Pixelabtastung, 0,67 nm pro Pixel.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lansky, S., Betancourt, JM, Zhang, J. et al. Ein pentamerer TRPV3-Kanal mit einer erweiterten Pore. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06470-1

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Eingegangen: 18. Januar 2023

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06470-1

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